细胞生物学的研究方法
形态观察
- 相差显微镜：没有染色的活细胞
- 微分干涉显微镜（DIC）：凹凸的立体感
- 荧光显微镜：
- 对细胞（膜）上组分（蛋白质核酸核糖）
- 定性定位研究（存在性&位置）
- 激光共聚焦显微镜：
- 更确切更精准更清楚地观察细胞结构
- 在Z轴（纵向）上进行“光学切片”构建三维体结构
- 扫描电镜：样品表面形貌
样品操作
- 分离细胞&细胞组分：差速离心、密度梯度离心
- 细胞分选：流式细胞仪
- 分子之间相互作用：酵母双杂交技术、FRET技术
- 分子的运动或迁移速率：荧光漂白恢复技术
- 细胞鉴定或分子是否表达：免疫荧光技术、免疫酶标技术
- 选择抗体要注意种属性
名词解释：FRET技术、荧光漂白恢复技术 - FRET技术：抗兔（FITC标记二抗）-> 兔抗大鼠（一抗） -> 大鼠
- 荧光漂白恢复技术
- 选择抗体要注意种属性
- Triton x-100（曲拉通）：破膜、打洞
- 适用于目标分子是跨膜蛋白抗体&抗胞外端抗体不能直接和目标分子结合
细胞质膜
细胞质膜：就是细胞膜，围绕在细胞最外层，由膜脂、蛋白质和糖类组成
细胞内膜：围绕各种细胞器的膜系统，细胞膜和细胞内膜统称为生物膜
细胞质膜的结构模型与基本成分
结构模型
- 三明治模型：”蛋白质-脂类-蛋白质”
- “单位膜模型”：暗亮暗+静止
- 流动镶嵌模型
- 流动性：膜蛋白、膜质均可侧向流动
- 膜蛋白分布具有不对称性：有的结合在膜表面，有的嵌入或横跨双分子层
- 脂筏模型：在生物膜的脂双层的外侧，鞘磷脂与胆固醇富集而形成有序的微功能区域，如同脂筏一样，上面载着蛋白质
- 分辨胆固醇与鞘磷脂：明显比磷脂双分子层高
生物膜的组成成分
- 膜脂：双分子
- 膜蛋白：去垢剂：Triton X-100
膜脂：
主要包括甘油磷脂、鞘脂、固醇（同时也是脂筏的主要成分）
甘油磷脂：膜脂基本成分，占一半以上
主要在内质网合成是3-磷酸甘油的一系列衍生物（PC，PS，PE，PI）- 甘油磷脂中某些成分如PI在细胞信号转导中起重要作用（磷脂酰肌醇双信使信号通路）
- 具有一个极性头和两个非极性尾
- 有饱和脂肪酸&不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸多为顺式
鞘脂：膜脂的基本成分，一半以上
- 鞘氨醇衍生物，主要在高尔基体合成。
- 糖脂：两性分子，极性头部直接共价键结合到鞘氨醇上的一个分子或寡糖链，普遍存在于原核和真核细胞的细胞质膜上
- 糖脂的连接：
- 低聚糖连接于神经酰胺，形成神经节苷脂
- 人类红细胞膜上与脂连接的低聚糖链决定人的血型
- ABO血型抗原叫做ABO血型决定子，是一种糖脂，其寡糖部分决定抗原特异性：A血型寡糖链末端是N-乙酰半乳糖胺，B是半乳糖，O是N-乙酰氨基半乳糖胺
固醇：胆固醇及其衍生物的统称，含有四个闭环并且其中有三个六C环一个五C环；亲水头为一个羟基（只有这一部分是亲水基团）。是一种分子刚性很强的两性化合物。
- 特点：
- 胆固醇在哺乳动物细胞质膜中含量丰富
- 多数细胞的绝大部分胆固醇在细胞质膜和相关囊泡上
- 来源：合成在动物细胞胞质和内质网，但动物体内的胆固醇多数来自于食物
- 作用：在调节膜的流动性，增加膜的稳定性以及降低溶水性物质的通透性等起重要作用，是脂筏的基本结构
- 缺乏胆固醇可能会抑制细胞分裂
- 特点：
膜脂的四种热运动方式
- 基本运动方式：沿膜平面侧向运动
- 脂分子围绕轴心的自旋运动
- 脂分子尾部的摆动
- 双层脂分子之间的反转运动
脂质体：概念+应用
- 脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的一种人工膜
- 应用：基因递送，细胞力学，原子力显微镜分子的锚定。总体而言就是一种载体作用。
- 研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质
- 脂质体中裹入DNA可用于基因转移
- 临床治疗中脂质体作为药物或酶载体
膜蛋白
基本类型
- 外在（周）膜蛋白：
- 水溶性蛋白
- 易分离：靠离子键等与膜内表面蛋白质或脂分子极性头部非共价键结合
- 内在（整合）膜蛋白：
- 水不溶性蛋白
- 跨膜螺旋，与膜紧密结合，常用去垢剂使膜崩解后才可分离
- 脂质锚定蛋白
- 通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合
- 外在（周）膜蛋白：
内在膜蛋白与膜脂结合方式
外在膜蛋白与膜脂结合方式
去垢剂:一端亲水，另一端疏水的两性小分子，是分离与研究膜蛋白的常用试剂，有离子型（SDS）和非离子型（Triton X-100）
- 这里会在设计实验中考查！免疫荧光染色中Triton X-100的作用：透化
- 免疫免疫要有抗原抗体的结合才可称为“免疫”
- Triton X-100的作用：溶解脂质，增加抗体对细胞膜的通透性，保证抗体可以接触到抗原结合位点。
- 必须打孔：核蛋白、抗原抗体结合位点位于胞内的跨膜蛋白、胞质内蛋白
- 不许打孔：抗原抗体结合位点在胞外的跨膜蛋白，胞外端蛋白
- 注意实验的设计：
- 这里会在设计实验中考查！免疫荧光染色中Triton X-100的作用：透化
细胞质膜的基本特征与功能
细胞质膜的基本特征：流动性与不对称性
膜的流动性
- 细胞膜的流动：主要由脂质分子本身的性质决定
- 脂肪酸链越短，不饱和程度越高，膜脂的流动性越大
- 温度对膜脂运动有明显的影响
- 胆固醇在动物细胞中对细胞膜流动性起重要的双向调节作用
- 膜蛋白的流动：荧光抗体免疫标记实验
- 成斑现象&成帽现象
- 影响膜流动性的因素：膜本身，遗传因子，环境因子。
- 胆固醇：胆固醇含量增加会降低膜的流动性
- 脂肪酸链的饱和度：越不饱和流动性越强
- 脂肪酸链的链长：越长相变温度越高，膜的流动性降低
- 卵磷脂：鞘磷脂：比值增高流动性增加，其中鞘磷脂为脂筏的主要成分，黏度高于卵磷脂
- 膜蛋白和膜脂的结合方式、温度、酸碱度、离子强度等
- 生理意义
- 保证其正常生理功能
- 过低时酶活动与物质运输终止，流动性过高造成膜的溶解
- 如何证明？
- 膜蛋白膜脂流动性研究&运动速率检测：荧光漂白恢复技术（FPAR）
- 研究膜蛋白&膜脂流动性基本实验技术：光脱色恢复技术
- 根据荧光恢复的速度推算出膜蛋白或膜脂扩散速度
膜的不对称性
ES：膜脂细胞外表面
膜脂的不对称性：糖脂仅存在于质膜的ES面，是完成生理功能的结构基础
- 是生物膜完成复杂的在时间控件上有序的各种生理功能的保证
- 应用：检测细胞凋亡：磷脂酰丝氨酸在凋亡早期由脂膜内测翻向外侧
膜蛋白的不对称性
- 糖蛋白糖残基均分布在质膜的ES面
- 指每种膜蛋白（糖侧链）分子在细胞膜上都具有明确的方向性
膜蛋白的不对称性:每种膜蛋白分子在质膜上明确的方向性
细胞质膜的基本功能
- 为细胞生命活动提供相对稳定的内环境
- 选择性物质运输，包括输入与代谢
- 产物的排除，其中伴随有能量的传递
- 提供细胞识别位点，完成细胞内外信息跨膜传递
- 为酶提供结合位点，酶促反应高校进行
- 介导细胞与细胞，细胞与胞质的连接
- 参与形成细胞表面特化结构
- 膜蛋白异常与疾病有关，可做疾病治疗靶标
膜骨架与细胞表面的特化结构
没啥要考的
回顾：
结构模型：
生物膜的组成
物质的跨膜运输
被动运输小批量，其余大批量，耗能
膜转运蛋白与小分子及离子的跨膜运输
载体蛋白
- 主动被动均需要
- 构象改变